摘要
炎癥性腸病(IBD)每年影響全球數(shù)百萬人。腸道活性氧(ROS)在IBD的生理病理中起著至關(guān)重要的作用辑畦。納米酶在治療IBD方面具有很大的前景吗蚌，因為它們在ros相關(guān)炎癥過程中具有調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)的特殊能力。然而纯出，用于IBD治療的口服耐酸抗氧化納米酶的快速發(fā)展具有挑戰(zhàn)性蚯妇。本研究建立了九層高通量篩選策略仅父，以滿足IBD治療的多方面需求虾宇，包括內(nèi)在穩(wěn)定性专缠、放射性奋岁、溶解度阿宅、腸道微生物組毒性缀辩、仿生元素势告、中間前沿分子軌道没佑、反應(yīng)能壘鸵赖、負(fù)電荷和耐酸性畏吓。從146 323個候選材料中選擇Ni3S4作為最佳匹配材料，它具有超氧化物歧化酶-過氧化氫酶雙酶樣活性卫漫，比天然酶的活性高3.13倍和1.80倍菲饼。小鼠模型表明，Ni3S4在胃腸道中穩(wěn)定無毒性列赎，并特異性靶向病變結(jié)腸減輕氧化應(yīng)激宏悦。RNA和16S rRNA測序分析表明，Ni3S4有效抑制促炎因子的細胞通路包吝，恢復(fù)腸道微生物群饼煞。本研究開發(fā)了一種用于IBD治療的高效口服級聯(lián)納米酶，并通過數(shù)據(jù)驅(qū)動的方法為納米藥物的合理設(shè)計提供了下一代范例诗越。
背景簡介
炎癥性腸病(IBD)是一種無法治愈的砖瞧、復(fù)發(fā)性的胃腸道慢性炎癥，主要發(fā)生在年輕人身上嚷狞。目前的臨床治療方法块促，如英夫利昔單抗和阿達木單抗荣堰，基于抗炎小分子藥物、免疫抑制劑和生物制劑竭翠，治療效果有限振坚，并導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥、耐藥性和長期免疫相關(guān)不良事件斋扰。IBD正變得越來越普遍渡八，每年報告的病例超過1000萬例，對全球衛(wèi)生保健系統(tǒng)構(gòu)成重大挑戰(zhàn)传货。納米催化醫(yī)學(xué)的進展為調(diào)節(jié)活性氧(ROS)相關(guān)炎癥的氧化還原穩(wěn)態(tài)提供了創(chuàng)新的方法屎鳍。其中，抗氧化納米酶是最具吸引力和有效的IBD治療選擇之一问裕，它可以緩解腸道氧化應(yīng)激逮壁，抑制患者腸道微生物群的炎癥損傷。盡管超氧化物歧化酶(SOD)樣納米酶不能完全清除活性氧僻澎，如?OH和H2O2貌踏，但過氧化氫酶(CAT)樣納米酶的組合產(chǎn)生了級聯(lián)納米酶系統(tǒng)(SOD-CAT)，具有增強的抗炎作用窟勃。此外祖乳，由于IBD的特異性病變和炎癥性結(jié)腸組織的特點，口服給藥需要對帶正電的炎癥粘膜具有高耐酸性和靶向特異性的納米藥物秉氧。雖然已經(jīng)報道了幾種具有上述特征的納米酶用于IBD納米酶治療眷昆，但大多數(shù)是采用經(jīng)驗或試錯方法設(shè)計的，這需要較長的開發(fā)時間和較高的成本汁咏。此外亚斋，多特征納米酶通常表現(xiàn)出不足的活性和相互約束的多酶樣活性。因此攘滩，合理設(shè)計用于IBD治療的納米酶是非常必要的帅刊。隨著計算化學(xué)的進步，基于量子力學(xué)/熱力學(xué)方法的分子模擬為在原子尺度上解決材料的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系提供了另一種方法漂问。這些模擬能夠從催化機制中得出與材料性能相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)閾值赖瞒，并利用材料數(shù)據(jù)庫和高通量篩選技術(shù)來開發(fā)具有目標(biāo)性能的材料。這種類型的材料設(shè)計已被用于開發(fā)納米酶蚤假。Wang等人設(shè)計了兩個原理(能級和吸附能原理)栏饮，利用密度泛函理論(DFT)計算來預(yù)測金屬有機框架的類鈉活性。Gao等人報道了基于吸附能的描述符和材料表面CAT類活性的標(biāo)準(zhǔn)磷仰，允許使用DFT計算對材料的H2O2靶向催化活性進行全面預(yù)測袍嬉。然而，關(guān)于多酶樣活性篩選標(biāo)準(zhǔn)的研究尚未報道灶平，納米酶的不同特征與各種IBD治療需求在高通量篩選中的整合是完全未知的伺通。在本研究中箍土，建立了一個強大的高通量計算策略來搜索用于IBD治療的納米酶(方案1)，該策略通過數(shù)據(jù)挖掘泵殴、篩選標(biāo)準(zhǔn)涮帘、DFT計算和分子動力學(xué)(MD)模擬拼苍，將多方面的治療需求轉(zhuǎn)化為數(shù)字化的材料特征笑诅，并從材料項目(MP)數(shù)據(jù)庫中篩選了>146 323種無機材料的候選材料。高通量篩選框架包括9個層次:固有穩(wěn)定性疮鲫、放射性吆你、溶解度碧磅、腸道微生物組毒性燕鸽、仿生元素、中間前沿分子軌道(iFMO)洼专、反應(yīng)能壘燕侠、負(fù)電荷和耐酸性者祖。60種具有SOD-CAT雙酶樣活性的材料被鑒定出來，與IBD治療最匹配的納米酶是Ni3S4绢彤。為了驗證預(yù)測的準(zhǔn)確性七问，合成了60種材料中預(yù)測SOD-CAT性能最好的4種材料(Ni3S4、Cu3Se2茫舶、MnTiO3和Cu2SnS3)械巡，并進行了理化和生物試驗。Ni3S4在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出優(yōu)越的療效饶氏，最能滿足IBD的治療需求讥耗。采用RNA測序(RNA-seq)和16S核糖體RNA測序(16S rRNA-seq)分析了納米酶治療IBD的分子機制。
結(jié)果與討論
根據(jù)IBD的多種治療需求制定了一個九層高通量篩選框架疹启。第一層是利用MP數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出的地層能量(ΔE hull)來識別在零K和零壓力下具有熱力學(xué)相穩(wěn)定性的材料古程，并通過原子序數(shù)極限來考慮計算表面的穩(wěn)定性和復(fù)雜性。值得注意的是喊崖，ΔE殼被定義為材料在相同化學(xué)成分下分解成一組最穩(wěn)定的材料的能量挣磨。選擇ΔE殼<20 meV原子?1的材料作為可合成的候選材料，而n - s <20且不超過三個組成元素的材料能夠在保持計算精度的同時避免計算冗余贷祈。共有17179個物料通過熱力學(xué)穩(wěn)定性篩選趋急。第二層和第三層從數(shù)據(jù)庫中提取放射性元素(如Po、Rn势誊、Fr呜达、Ra、Ac粟耻、Th查近、Pa和U)和可溶性金屬離子(如Be2+眉踱、Na+和K+)，共篩選了6564個候選元素霜威。第四層選擇的材料不含四種重金屬元素(Cd谈喳、Hg、Pb和As)戈泼，這些元素會導(dǎo)致腸道微生物群嚴(yán)重失調(diào)婿禽，并與IBD的發(fā)病密切相關(guān)，4562種材料符合這一標(biāo)準(zhǔn)大猛。第五層篩選涉及對天然SOD和CAT在Mn扭倾、Fe、Ni和Cu元素范圍內(nèi)的催化活性中心進行仿生設(shè)計挽绩。這一層尋找含有上述一種或兩種金屬元素的材料膛壹，但總共不超過三種元素，并選擇了1608個候選元素唉堪。第六層篩選是納米酶在能量水平上的分類標(biāo)準(zhǔn)模聋。基于SOD和CAT 樣納米酶的催化機制唠亚，將材料的iFMO設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)链方。SOD和CAT樣納米酶均發(fā)生歧化。歧化半反應(yīng)的氧化還原電位在電子轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用趾撵。以往的研究表明侄柔，iFMO位于歧化半反應(yīng)電位之間的材料具有相應(yīng)的納米酶活性。由于SOD的氧化還原電位范圍存在重疊(-0.18至 -0.91V)和CAT(0.29至-0.91V)占调，具有iFMO的材料位于重疊電位(0.29-0.91V)范圍內(nèi)暂题。被認(rèn)為具有雙酶樣活性。共篩選了60份材料究珊。在第七層篩選中薪者，考慮不同的反應(yīng)底物、反應(yīng)途徑和活性中心剿涮，計算60種材料的全SOD和CAT樣反應(yīng)途徑的能壘言津，確定其CAT和SOD樣活性。以0.5 eV為最大反應(yīng)能(ΔGlim1)為閾值取试，篩選了四種最佳材料(Ni3S4悬槽、Cu3Se2、MnTiO3和Cu2SnS3)瞬浓。第八層篩分采用負(fù)zeta電位材料初婆。由于帶正電荷的蛋白質(zhì)在發(fā)炎的腸道中富集，表面帶負(fù)電荷的納米酶靶向發(fā)炎部位以增強其治療效果。采用三種材料進行篩選第九層篩選評估口服給藥的酸耐受性磅叛。非金屬的溶解能是耐酸性能的主要指標(biāo)屑咳。因此，Ni3S4被選為IBD納米酶治療的最佳匹配材料弊琴。天然SOD或CAT通過 機制催化歧化兆龙，其中O2?-或H2O2交替作用，還原被氧化的金屬離子并氧化被還原的金屬中心敲董。這種特殊的電子傳遞方式為SOD或CAT金屬中心的氧化還原電位設(shè)定了標(biāo)準(zhǔn)(圖S1紫皇，支持信息)。要使SOD或CAT反應(yīng)在熱力學(xué)上有利進行臣缀，SOD的必須在- 0.18V (O2??/H2O2)和0.91V(O2??/O2)之間坝橡，CAT的必須在0.29V (O2??/H2O2)和1.36V(H2O2/H2O)涩拙。之間反應(yīng)中負(fù)責(zé)電子轉(zhuǎn)移的材料的電子能級與天然酶不同嫂易，被定義為前沿分子軌道(FMO)仁锯，其中涉及半導(dǎo)體的導(dǎo)帶最小值(CBM)和價帶最大值(VBM)以及導(dǎo)體的費米能級(EF)，并且已被證明能夠篩選CAT或SOD樣納米酶脂倦。因此，當(dāng)材料的FMO介于0.29和0.91V之間時,假設(shè)其具有熱力學(xué)有利的SOD-CAT雙酶樣活性元莫，其FMO定義為iFMO赖阻。圖1A描述了材料在SOD-CAT級聯(lián)反應(yīng)中催化的四種機制。I型表示CBM或EF為iFMO踱蠢，其中反應(yīng)由最高占據(jù)分子軌道(HOMO)介導(dǎo)火欧，遵循HOMO介導(dǎo)機制。II型代表VBM或EFas iFMO茎截，其中反應(yīng)由最低未占據(jù)分子軌道(LUMO)介導(dǎo)苇侵，遵循LUMO介導(dǎo)的機制。III型表明材料中既有未占用的iFMO (CBM或EF)企锌，也有占用的iFMO (VBM或EF)榆浓，并且催化反應(yīng)遵循整體中性中間體的共介導(dǎo)機制。IV型缺乏iFMO撕攒，禁止SOD-CAT級聯(lián)反應(yīng)陡鹃。根據(jù)iFMO的類型，將所有通過熱力學(xué)穩(wěn)定性篩選的506種材料分為半導(dǎo)體和導(dǎo)體組抖坪。使用MP數(shù)據(jù)庫收集所有材料的iFMO數(shù)據(jù)萍鲸，如支持信息(支持文件2)所示。從169種半導(dǎo)體中篩選出26種材料擦俐，從337種導(dǎo)體中篩選出34種材料脊阴，均表現(xiàn)出雙酶樣活性;55份材料未見報道(圖1B,C)。通過數(shù)據(jù)可視化研究材料特性與SOD-CAT雙酶樣活性之間的關(guān)系。根據(jù)是否存在類雙酶活性和15個重要特征變量(圖1D)對材料進行分類:原子序數(shù)蹬叭、材料類型藕咏、金屬類型、原生金屬價秽五、次生金屬價孽查、非金屬價、多價金屬的存在坦喘、體積盲再、密度、原子能瓣铣、原子形成能答朋、帶隙和iFMO (CBM、VBM或EF)棠笑。含有多價態(tài)Cu梦碗、Mn和Ni的材料更有可能具有SOD-CAT雙酶樣活性，如MnPS3蓖救、CuPS3洪规、Cu4SnP10和ln2Ni3S2。非金屬價態(tài)的范圍影響類雙酶活性;非金屬價態(tài)的范圍越大循捺，就越容易發(fā)生類雙酶活性斩例。當(dāng)C和Si以陰離子形式存在時，例如Sc(FeSi)2从橘、SiNi念赶、Mn5C2和FeB，很難獲得顯著的SOD-CAT雙酶樣活性恰力。
B叉谜、C) 506種材料的能級標(biāo)準(zhǔn)篩選。D)使用R軟件中的“tabplot”包繪制iFMO對應(yīng)的整個數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)分布牺勾。經(jīng)過能級標(biāo)準(zhǔn)篩選正罢，鑒定出60個具有SODCAT雙酶樣活性的化合物。為了量化篩選材料的納米酶活性驻民，并排除與底物具有強化學(xué)相互作用導(dǎo)致雙酶類活性喪失的材料翻具，我們計算了60種材料的活性晶面的SOD和cat類反應(yīng)全途徑的熱力學(xué)屏障(圖S2，表S1,S2回还，支持信息)裆泳。在O2??和H2O2歧化的關(guān)鍵中間態(tài)和過渡態(tài)結(jié)構(gòu)中，用不同的軌道介導(dǎo)機制作為分界線柠硕。這種Homo介導(dǎo)的機制導(dǎo)致電子損失工禾。帶正電的物質(zhì)(M+)是這個反應(yīng)的中間物运提。在類SOD反應(yīng)(圖2A)中，第一個質(zhì)子化的O2??(HO2?)從H2O吸附物中奪取H原子形成H2O2闻葵，并將物質(zhì)(M)氧化生成中間產(chǎn)物M+─OH(1)民泵。第二個HO2?將其H原子交給M+─OH生成H2O和O2，并將M+?OH還原為初始狀態(tài)M(2)槽畔。Homo介導(dǎo)的CAT樣反應(yīng)的中間體也帶M+正電荷(圖2B)栈妆。第一個H2O2與M的活性金屬中心結(jié)合，導(dǎo)致O─O鍵斷裂厢钧，隨后分子內(nèi)H原子轉(zhuǎn)移生成中間產(chǎn)物M+─O鳞尔，釋放H2O(式(3))。第二個H2O2與M+─O反應(yīng)生成O2, M+─O還原為初始狀態(tài)早直。這種Lumo介導(dǎo)的機制允許材料獲得電子寥假。帶負(fù)電的M?是這個反應(yīng)的中間產(chǎn)物。在類SOD反應(yīng)(圖2C)中霞扬，M氧化第一個HO2?生成O2糕韧，而M被還原為還原態(tài)M?─H(5)。第二個HO2?從M?─H中取走H原子祥得，而M被氧化為初始態(tài)M(6)兔沃。M?是Lumo介導(dǎo)的CAT樣反應(yīng)的中間體(圖2D)。第一個H2O2與M的活性金屬中心結(jié)合级及，發(fā)生分子內(nèi)H原子轉(zhuǎn)移，釋放O2额衙，生成中間產(chǎn)物M?─2H饮焦。然后，第二個H2O2與M?2H反應(yīng)生成H2O , M?2H被氧化回初始狀態(tài)M(8)窍侧。基于以上兩種催化機制(HOMO-和LUMO-介導(dǎo))衍生出的四種反應(yīng)途徑毕源，計算了31種LUMO -介導(dǎo)材料和29種HOMO-介導(dǎo)材料的綜合SOD-和CAT-樣反應(yīng)途徑的反應(yīng)能怠堪。極限勢(ΔGlim1)被定義為SOD-和CAT -樣反應(yīng)的最高熱力學(xué)勢壘。60種材料中，SODCAT反應(yīng)中Cu2SnS3 (HOMO介導(dǎo))何暇、Ni3S4 (LUMO介導(dǎo))、MnTiO3 (LUMO介導(dǎo))和Cu3Se2 (LUMO介導(dǎo))的ΔGlim1均<0.5 eV(圖2E;圖S3,S4玻靡，支持信息)冠桃，表明這四種材料在熱力學(xué)和動力學(xué)上都有利于級聯(lián)反應(yīng)。根據(jù)上述反應(yīng)能計算結(jié)果咧织，確定了HOMO-和LUMO -介導(dǎo)的SOD-和CAT -樣反應(yīng)的反應(yīng)規(guī)律嗓袱。對于homo介導(dǎo)的反應(yīng)，類SOD反應(yīng)的速率決定步驟一般發(fā)生在HO2?與H原子反應(yīng)生成H2O2的步驟习绢，而類CAT反應(yīng)的速率決定步驟是第一個H2O2的O─O鍵的斷裂渠抹。LUMO介導(dǎo)的類SOD反應(yīng)的速率決定步驟是第一個O-OH的O─H鍵的斷裂蝙昙，而類CAT反應(yīng)的速率限制步驟是第一個H2O2的O─H鍵和O鍵的斷裂。為了確定治療IBD的最佳納米酶梧却，在篩選過程中考慮了治療需求奇颠，包括負(fù)zeta電位和耐酸性。將DFT計算和MD模擬相結(jié)合放航，計算了四種材料的zeta電位大刊。圖2F顯示了經(jīng)典雙電層(EDL)中界面電位與表面距離的函數(shù)示意圖。表面電位(?)在表面官能團的平面上產(chǎn)生三椿，擴散層在距離表面Xd處出現(xiàn)缺菌。zeta電位()在擴散層(藍色虛線)的頭端得到，它限制了界面處的停滯層搜锰。表面電位計算表明伴郁，Ni3S4、Cu3Se2和Cu2Sn3具有負(fù)的zeta電位蛋叼，可以特異性結(jié)合炎癥(圖2G;圖S5,S6焊傅，支持信息)。利用離散傅里葉變換計算了四種材料的耐酸能狈涮、金屬溶解能和非金屬空位形成能狐胎。材料的耐酸性可以通過其表面的溶解速率來確定，這涉及到金屬的溶解和由于H2O的去質(zhì)子化而形成的晶格陰離子空位(圖2H;圖S7歌馍，支持信息)握巢。由于它們出現(xiàn)的先后順序與材料表面性質(zhì)有關(guān)，因此分別計算了兩種途徑的反應(yīng)能(表S3, Supporting Information)松却。結(jié)果表明暴浦，雖然整個反應(yīng)是放熱的，但晶格陰離子的溶解是兩種反應(yīng)中熱力學(xué)最不利的一步晓锻。因此歌焦，這一步的自由能變化(ΔGlim2) c an b被用來確定溶解速率。Ni3S4的ΔGlim2為10.15 eV(圖2I)砚哆，在Ni3S4独撇、Cu3Se2、Cu2SnS3和MnTiO3中耐酸性最強躁锁。此外纷铣，研究了表面的氧化態(tài)以了解其耐酸性。根據(jù)Mulliken電荷分析灿里，Ni3S4中從Ni轉(zhuǎn)移到S的電子數(shù)量比Cu3Se2和Cu2SnS3中要多(圖S8关炼，支持信息)，驗證了最強的Ni─S 鍵 匣吊。投影態(tài)密度計算表明儒拂，Ni3S4晶格陰離子的2p軌道位于費米能級以下(圖S9, Supporting Information)寸潦，表明Ni3S4具有優(yōu)異的耐酸性∩缤矗總的來說见转，Ni3S4是口服IBD治療的最佳納米酶。
為了驗證九層高通量篩選的準(zhǔn)確性蒜哀，我們合成了四種具有優(yōu)異SOD-CAT性能的材料:Ni3S4斩箫、C u3Se2、MnTiO3和Cu2Sn3撵儿，它們具有納米花乘客、納米顆粒、納米圓盤和覆樹莓樣的形貌淀歇，如圖3A所示易核。x射線衍射(XRD;圖3B)和x射線光電子能譜(XPS，圖3C;圖S10(支持信息)用于表征這些材料的晶體結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分;表征細節(jié)在支持信息中提供浪默。通過循環(huán)伏安法測量了四種材料的氧化還原電位牡直，曲線與MP數(shù)據(jù)庫中的模擬數(shù)據(jù)一致(圖S11, Supporting Information)，表明這些材料符合上文討論的SOD-CAT類雙酶標(biāo)準(zhǔn)纳决。并對四種材料的類sod活性和自由基清除能力進行了評價碰逸。已知的生物腸道自由基包括O2??、2,2′-偶氮(3乙基苯并噻唑-6-磺酸)陽離子自由基(ABTS?+)阔加、2,2二苯基肼基自由基(DPPH?)和羥基自由基(?OH)饵史。四種材料均表現(xiàn)出優(yōu)異的自由基清除能力(圖3D-G;圖S12-S17(支持信息)，性能趨勢如下:
結(jié)果表明掸哑，Cu2SnS3具有較高的?OH清除能力约急，Ni3S4具有最強的綜合自由基清除能力，其SOD樣活性是天然SOD的3.84倍苗分，也是目前報道的大多數(shù)非復(fù)合SOD樣納米酶的活性(圖S18, Supporting Information)。通過使用溶解氧計檢測H2O2分解產(chǎn)生的O2來驗證CAT類活性牵辣。在pH為9.2摔癣、反應(yīng)時間為20 min時，CAT-樣活性的變化趨勢為Ni3S4 > MnTiO3 > CAT > Cu3Se2 > Cu2SnS3(圖3H;圖S19纬向，支持信息)择浊，Ni3S4的H2O2清除活性比天然CAT高1.83倍。除了活性氧清除能力外逾条，耐酸性是納米酶治療IBD的另一個基本特征琢岩。為了證實這些材料的耐酸性是否與模擬結(jié)果相符，在37℃下师脂，用模擬胃液(SGF, pH 1.2-1.5, 0.12-0.15 m HCl溶液)處理3小時后担孔，測量了它們的SOD-CAT雙酶樣活性[21]Ni3S4的SOD-和CAT樣活性下降幅度最小江锨，分別為21.1%和13.9%。Cu3Se2和Cu2SnS3的SOD樣活性分別下降了24.2%和29.5%糕篇，CAT樣活性分別下降了25.4%和35.1%啄育。MnTiO3受到SOD和CAT樣活性的顯著影響，分別下降了51.0%和50.8%(圖3I;圖S20-S22拌消，支持信息)挑豌。然后，對SGF處理后的材料的粒徑和分散性進行了評價墩崩。MnTiO3耐酸性較差氓英，粒徑和分散性發(fā)生明顯變化，溶液顏色也發(fā)生變化鹦筹。相比之下铝阐，Ni3S4表現(xiàn)出了顯著的耐酸性，經(jīng)過SGF處理后盛龄，其粒徑和分散性幾乎沒有改變(圖S23,S24饰迹，支持信息)。這些發(fā)現(xiàn)與SGF處理前后的納米酶活性測量結(jié)果一致余舶，證實了Ni3S4的預(yù)期耐酸性啊鸭。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測SGF處理的Ni3S4的穩(wěn)定性。SGF處理3 h后匿值，Ni3S4仍保持其晶體結(jié)構(gòu)(圖S25赠制，支持信息)。負(fù)的zeta電位是IBD治療的另一個重要特征挟憔，它允許物質(zhì)靶向炎癥部位如圖3K所示钟些，正常情況下Ni3S4的zeta電位為- 18.2±2.6 mV, SGF處理后Ni3S4的zeta電位保持不變(- 17.1±1.9 mV)，證實了胃酸后Ni3S4靶向炎癥腸道組織的zeta電位為負(fù)(圖S26, Supporting Information)绊谭。Ni3S4的總體表現(xiàn)與口服IBD治療的最佳匹配(圖3L)政恍，這與高通量預(yù)測一致。為了進一步證明Ni3S4在口服IBD治療中的潛力达传，我們使用電子順磁共振(EPR)來評估其清除自由基的能力篙耗。如圖3M所示，經(jīng)SGF處理后宪赶，其變化不大宗弯。將Ni3S4的酶樣活性與天然SOD和CAT進行比較。正常情況下搂妻，Ni3S4的SOD樣活性為437U mg?1,CAT活性為615U mg?1(圖3N)蒙保，分別比天然SOD和CAT的活性高1.80倍和3.13倍。SGF處理后欲主，SOD和CAT樣活性分別為332.9和422U mg?1，在正常情況下仍大于天然酶的活性(圖3O)。
用脂多糖(LPS)處理RA W264.7巨噬細胞荔棉，刺激細胞內(nèi)ROS的過量產(chǎn)生。如圖4A所示懈糯，四種材料均能在細胞內(nèi)清除活性氧。流式細胞術(shù)定量測定細胞內(nèi)ROS水平单雾。從圖4B赚哗、C可以看出，四種材料對ROS的清除率依次為Ni3S4 (95.58%) > Cu2SnS3(82.16%) > Cu3Se2 (69.78%) > MnTiO3(66.54%)硅堆，這與動力學(xué)測量結(jié)果一致屿储，強調(diào)了在體外具有顯著的ROS清除率，尤其是Ni3S4 (T表S4, Supporting Information)渐逃。為了研究Ni3S4的抗炎活性够掠，我們分析了關(guān)鍵炎癥細胞因子，如白細胞介素-1γ(IL-1γ)茄菊、γ干擾素(IFN-γ)疯潭、白細胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素-10 (IL-10)的mRNA表達(表S5面殖，支持信息)竖哩。如圖4D-H所示，在RA W 264.7細胞中脊僚，Ni3S4組中與細胞炎癥發(fā)生相關(guān)的IL-1γ相叁、I F N -γ、IL-6和TNF-α的促炎因子水平低于LPS組辽幌。相反增淹，抑制炎癥細胞因子產(chǎn)生的IL-10水平在LPS處理組中顯著升高，證實Ni3S4可以減輕體外炎癥反應(yīng)乌企。此外虑润，由于ROS誘導(dǎo)的細胞凋亡是主要的繼發(fā)性損傷因素，我們在體外研究Ni3S4是否可以減少ROS誘導(dǎo)的細胞凋亡加酵。流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示(圖4I,J)端辱， Ni3S4顯著降低LPS誘導(dǎo)的細胞凋亡61.96%。采用腸上皮細胞(IEC) MODE-K檢測Ni3S4的生物相容性虽画。細胞暴露于不同濃度(0 ~ 100 μm)的Ni3S4中24 h。圖S27(輔助信息)顯示荣病，濃度高達100 μg m L?1的Ni3S4對細胞增殖沒有影響码撰。活細胞和死細胞的免疫熒光染色證實了Ni3S4的體外生物相容性个盆。此外脖岛，還探討了Ni3S4與IEC MODE-K的相互作用機理朵栖。Ni3S4粘附在細胞膜上，并通過囊泡(圖S29,S30柴梆，輔助信息)以時間依賴性的方式運輸?shù)郊毎麅?nèi)部(圖S31陨溅，輔助信息);wortmannin處理后，Ni3S4的細胞攝取受到顯著影響(圖S32绍在，支持信息)门扇，表明巨量胞飲途徑占主導(dǎo)地位。
通過DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型研究Ni3S4口服治療IBD的療效(圖5A)偿渡。用3% DSS飼喂小鼠7 d后臼寄，誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)腸炎。將小鼠隨機分為健康組(空白對照組)溜宽、腸炎組(DSS吉拳，陰性對照組)、5-氨基水楊酸治療組(DSS+5-ASA适揉，陽性對照組);5-ASA是IBD的一線藥物)留攒，Ni3S4治療(DSS + Ni3S4，實驗組)嫉嘀。陽性對照組和治療組每天灌胃口服5-ASA或Ni3S4炼邀，通過測定結(jié)腸長度、脾臟吃沪、體重及疾病活動指數(shù)(DAI)評價Ni3S4的治療效果汤善。與DSS組相比，DSS + Ni3S4和DSS + 5-ASA組結(jié)腸長度更長(圖5B票彪、D)红淡，脾臟重量更輕(圖5C、E)降铸，體重更高(圖5F)在旱， DAI更低(圖5G)。值得注意的是推掸，DSS + Ni3S4與健康組之間的差異明顯小于DSS + 5-ASA與健康組之間的差異桶蝎。這些結(jié)果表明，4 mg kg - 1 Ni3S4比50 mg kg - 1 5-ASA治療DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎更有效谅畅，優(yōu)于大多數(shù)報道的納米酶(表S6登渣，支持信息)。各組結(jié)腸切片蘇木精和伊紅(H&E)染色結(jié)果相似毡泻。結(jié)腸炎小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的隱窩破壞胜茧，組織學(xué)塌陷，大量免疫細胞浸潤，炎癥結(jié)腸嚴(yán)重的結(jié)腸上皮損傷呻顽，而DSS + Ni3S4組組織學(xué)微結(jié)構(gòu)基本正常雹顺，炎癥細胞浸潤較少(圖5H)。髓過氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)由中性粒細胞表達廊遍，在炎癥組織中催化反應(yīng)性物質(zhì)和次氯酸的形成嬉愧，參與IBD的調(diào)控。在圖5H中喉前，DSS組結(jié)腸組織中MPO水平升高没酣，但Ni3S4治療后MPO的聚集量大幅下降，證實Ni3S4可以成功改善IBD癥狀被饿。Ni3S4的治療成功依賴于其靶向特定病變的能力四康，同時最大限度地減少對其他器官的損害。采用ICPMS評價Ni3S4的生物安全性和代謝性能狭握。Ni3S4處理小鼠的心臟闪金、肝臟、脾臟论颅、肺和腎臟中均未檢測到高水平的金屬離子哎垦，但在結(jié)腸組織和糞便中觀察到相當(dāng)多的金屬離子殘留(圖5I)，這表明Ni3S4針對發(fā)炎的結(jié)腸組織恃疯，并在不被組織細胞吸收的情況下安全地排出體外漏设。透射電子顯微鏡(TEM)圖像顯示，Ni3S4粘附在富含正電荷蛋白的結(jié)腸炎病變上(圖5J)今妄，并在4天內(nèi)被移除(圖S33-S35郑口，支持信息)。此外盾鳞，通過溶血實驗評估Ni3S4的血液毒性犬性，在濃度為100 μg m L?1時，觀察到溶血率<2%(圖S36腾仅，支持信息)乒裆。我們評估了Ni3S4對主要器官和血液常規(guī)的體內(nèi)毒性，口服Ni3S4后推励，兩者均未受到影響(圖S37,S38鹤耍，支持信息)還研究了Ni3S4在胃腸道中的耐酸性。在粒度分布(圖S39验辞，輔助信息)和元素組成(圖S40稿黄，輔助信息)方面沒有觀察到顯著差異。為定量測定Ni3S4的滯留時間跌造，分析口服給藥后腸內(nèi)Ni濃度;Ni3S4在小鼠胃液中的溶解度被檢測(圖S41抛猖，支持信息)。圖S42(輔助信息)顯示，Ni3S4在1 h內(nèi)的溶出率<1%财著，說明Ni3S4在體內(nèi)具有良好的耐酸性。
我們對小鼠結(jié)腸組織進行RNA-seq分析撑碴，以闡明Ni3S4治療IBD的機制撑教。對照組、DSS組醉拓、DSS+ 5-ASA組和DSS+Ni3S4組基因表達水平的差異以每百萬定位片段的外顯子模型千堿基片段數(shù)表示伟姐。火山圖(圖6A)顯示亿卤，與健康組相比愤兵，DSS組有1569個上調(diào)基因和962個下調(diào)基因。相比之下排吴，DSS+Ni3S4組有532個基因上調(diào)秆乳，480個基因下調(diào)，提示炎癥的影響钻哩。Venn圖分析揭示了轉(zhuǎn)錄組譜的顯著差異屹堰，DSS + Ni3S4組在總基因、上調(diào)基因和下調(diào)基因方面表現(xiàn)出比DSS + 5-ASA組更高的變異性(圖6B)街氢。這些數(shù)據(jù)表明Ni3S4治療是有效的扯键，并且對正常腸道沒有實質(zhì)性影響，因為它與健康組沒有差異珊肃。歸一化熱圖(圖6C)顯示荣刑，Ni3S4處理后IBD小鼠腸道組織中應(yīng)答ROS的基因數(shù)量大幅減少。為了闡明潛在的治療機制伦乔，篩選的基因進行聚類和富集分析厉亏。使用基因本體(Gene Ontology, GO)數(shù)據(jù)庫對差異表達的炎癥基因(differential expression inflammatory genes, DEGs)進行功能聚類分析，以log2 (fold change)作為評估標(biāo)準(zhǔn)评矩。結(jié)果表明叶堆，DSS組和DSS + Ni3S4組之間的基因表達差異與8個氧化石墨烯類別有關(guān):炎癥反應(yīng)、趨化因子信號通路以及趨化因子IL1斥杜、IL-6和TNF-α產(chǎn)生的調(diào)節(jié)(圖6D)虱颗。基因集富集分析(GSEA)顯示蔗喂，在DSS組中忘渔，ROS上調(diào)的基因高度富集(圖6E)，但在加入Ni3S4后缰儿，這些基因的表達水平降至正常水平畦粮。功能通路富集分析(使用京都基因與基因組百科全書[KEGG])顯示，趨化因子、TNF?宣赔、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)- akt预麸、核因子κ B (NF-kB)、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路均與Ni3S4的治療機制相關(guān)(圖6F;圖S43,S44儒将，支持信息)吏祸。先前有研究報道NFkB信號通路參與TNF-α、IL-1钩蚊、IL-6等促炎細胞因子的產(chǎn)生贡翘，與IBD的發(fā)病密切相關(guān)。PI3K-Akt信號通路對NF-?B信號通路的激活起著至關(guān)重要的作用砰逻。Ni3S4處理后鸣驱，所有ROS相關(guān)的細胞通路均顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明蝠咆，Ni3S4通過降低ROS水平和抑制NF-kB踊东、趨化因子和其他炎癥信號通路來減輕小鼠模型中的結(jié)腸炎癥。有趣的是勺美，Ni3S4處理影響了PI3K-Akt和toll樣信號通路递胧，這表明Ni3S4可能在IBD治療中調(diào)節(jié)腸上皮屏障修復(fù)和腸道微生物群中發(fā)揮作用。 
腸道菌群紊亂與IBD的發(fā)病和進展密切相關(guān)赡茸。[26]腸道微生物群被認(rèn)為是促氧化劑的主要來源[27]缎脾，ROS的過量產(chǎn)生可能導(dǎo)致腸道屏障功能障礙和潛在有害細菌(如致病性厭氧菌)的擴張[28]。為了探究Ni3S4是否影響腸道菌群的組成和豐度占卧，我們進行了16S rRNA-seq遗菠。相對豐度條形圖(圖7A)描繪了不同群體，說明了不同環(huán)境中微生物的存在以及每一群體在門水平上的相對豐度华蜒。腸道菌群主要由擬芽孢桿菌辙纬、產(chǎn)氣莢膜梭菌、脫硫弧菌和酸微生物組成叭喜。D SS + Ni3S4組微生物種類的多樣性和豐度高于健康組贺拣。非度量多維尺度分析(NMDS)消除了對實際距離值的依賴，用于評估四組微生物群落的相似距離矩陣(圖7B,C)捂蕴。四組之間的腸道微生物組成和功能分類存在顯著差異譬涡，Ni3S4處理后的樣品中微生物多樣性明顯高于炎癥組(圖S45,S46，支持信息)啥辨，反映了Ni3S4對結(jié)腸炎小鼠微生物組結(jié)構(gòu)的顯著影響涡匀。使用微生物聚類熱圖(圖7D)分析了50個顯著不同家族的相對豐度。Ni3S4處理顯著提高了Ruminococcaceae和Prevotellaceae的相對豐度溉知，這兩種細菌產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA)陨瘩，調(diào)節(jié)腸道屏障功能腕够。與DSS組相比，DSS + Ni3S4組胃腸道主要致病菌的相對豐度降低舌劳，如Bacteroides(0.151-0.068)和Alistipes(0.074-0.021)帚湘。然而，益生菌的種類和豐度有所增加(圖7E)蒿囤，如Muribacusaceae(0.175-0.200)和Prevotellaceae(0.012-0.081)客们。采用α多樣性法測定四組微生物的物種豐度和多樣性。DSS + Ni3S4組的ACE材诽、Shannon和Simpson指數(shù)顯示，Ni3S4治療增加了觀察到的操作分類單位(operational taxonomic units, OTUs)的數(shù)量恒傻，表明Ni3S4對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響與常規(guī)抗炎藥相當(dāng)(圖7F-H)脸侥。上述轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)表明，Ni3S4可以恢復(fù)腸道屏障盈厘，調(diào)節(jié)IBD病變部位的菌群平衡睁枕。
結(jié)論
在本研究中，我們建立了一個九層高通量篩選策略沸手，結(jié)合一種計算方法來解決IBD的多方面治療需求外遇。篩選階段主要基于納米酶的固有穩(wěn)定性、放射性契吉、溶解度跳仿、腸道微生物毒性、仿生元素捐晶、iFMO菲语、反應(yīng)能壘、負(fù)電荷和耐酸性惑灵，從而合理設(shè)計納米酶藥物山上。該策略提出了篩選抗氧化劑SOD-CAT類雙酶活性的熱力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，將材料范圍擴大到>1500種穩(wěn)定且生物安全的材料英支，并闡明了一系列可作為IBD治療候選藥物的納米酶佩憾。有趣的是，化學(xué)和生物學(xué)測試以及生物信息學(xué)分析證實干花，最佳匹配的納米酶Ni3S4的活性分別是天然SOD和CAT活性的3.13倍和1.80倍妄帘，能夠靶向炎癥腸道，減輕炎癥把敢，修復(fù)受損的腸道屏障寄摆，恢復(fù)腸道微生物群，平衡腸道微環(huán)境修赞。綜上所述婶恼，本研究為基于材料大數(shù)據(jù)和疾病特征的IBD治療多酶樣納米酶的按需設(shè)計提供了新一代數(shù)據(jù)驅(qū)動方法桑阶，從而加速了基于納米酶的藥物發(fā)現(xiàn)和臨床轉(zhuǎn)化。
文獻參考
Rational Design of Orally Administered Cascade Nanozyme for Inflammatory Bowel Disease Therapy
Yixin Yu, Xianguang Zhao, Xudong Xu, Chenwen Cai, Xuemei Tang, Qingyun Zhang, Liang Zhong, Fusheng Zhou, Dongqin Yang, Zhiling Zhu First published: 23 August 2023
https://doi.org/10.1002/adma.202304967